Aruera: una planta que genera alergias y mitos

Estudio analítico de los volátiles emitidos in vivo por plantas de soja (Glycine max) y su relación con su principal plaga en el Uruguay: Piezodorus guildinii (Hemiptera: Pentatomidae).

Tesina de Licenciatura en Química. Junio de 2010. Tutor: Prof. Dr. Andrés González Ritzel. Colaboración: Prof. Dr. Enrique Castiglioni.

Laboratorio de Ecología Química. Facultad de Química. Universidad de la República. Montevideo, Uruguay.

Resumen

En éste trabajo se realizó la colecta de compuestos orgánicos volátiles (VOCs) de soja a campo, y el análisis de los mismos en el laboratorio para determinar los perfiles de emisión en los diferentes estadios de desarrollo fenológico. Además se realizó una evaluación de los mismos frente a individuos de P. guildinii (principal plaga de la soja en Uruguay) por ensayos comportamentales y estudios electrofisiológicos (GC-EAD) en la búsqueda de  posibles kairomonas utilizadas por los insectos para ubicación de su fuente alimenticia. 

Introducción

Glycine max, la soja.

La soja, Glycine max (L.) Merrill  es una planta anual erecta de 50-90 cm. de altura  perteneciente a la familia Fabaceae, subfamilia Faboideae. Sus hojas son compuestas trifoliadas, salvo las basales que son unifoliadas y se caen antes de que la planta llegue a su estado de madurez fisiológica. Sus flores son pequeñas de alrededor de 8 mm de longitud de corola blanca o violácea y los frutos son legumbres o vainas péndulas (figura 1).

Figura 1: Glycine max; planta en estadio reproductivo y semillas.

La soja es originaria de Asia Oriental, donde es cultivada desde la antigüedad, y desde allí se difundió a los países occidentales basado en su gran potencial alimenticio. Sus semillas son ricas en proteínas y aceites, lo que la hace sustituta de muchos productos de origen animal como la carne. También es de gran utilidad para la producción de biocombustibles y plásticos. Presenta un importante contenido de isoflavonoides que previenen el cáncer de mama, entre otros.

Existen varios cientos de variedades de soja que difieren por el color y las formas de las semillas, así como por las características morfológicas de las plantas. Se caracteriza por ser una especie muy sensible a las variaciones microclimáticas, por lo cual requiere un cuidadoso trabajo de selección de variedades antes de encontrar la de mayor rendimiento para una región dada. Como todas las leguminosas, es una excelente especie para utilización en esquemas de rotación de cultivos, debido a la capacidad de fijar nitrógeno de las bacterias simbióticas del género Rhizobium que habitan sus nódulos radicales.

Existe un convención entre especialistas para la descripción de los estadios de desarrollo fenológico de la soja donde los estadios vegetativo y reproductivo son descriptos separadamente. Los estadios vegetativos son determinados por conteo del número de nudos del tallo principal, comenzando por el nudo unifoliado. Los estados reproductivos R₁ y R₂ corresponden a la floración, R₃ y R₄ al desarrollo de las vainas (llenado), R₅ y R₆ responden al desarrollo de las semillas, y, R₇ y R₈ a la madurez fisiológica (ver figura 2). Este sistema es aplicado tanto para plantas aisladas como para cultivos. La cantidad de estadios vegetativos varía según la variedad de soja que se esté considerando y las condiciones ambientales reinantes. Por ejemplo Fehr et. al observaron el comienzo de la floración desde los 4 hasta 18 nudos en el tallo principal. Para éste sistema descriptivo se consideran los estadios reproductivos basados en el desarrollo de la porción superior del tallo, independizando del genotipo y ambiente de la planta. Así R₁ designa la existencia de una flor en algún nudo (generalmente el superior) y R₂ designa la presencia de floración en el nudo inmediatamente por debajo del superior .

Figura 2: Estadios de desarrollo fenológico de la soja, según Fehr et. al.

Nota: en el diagrama no se presentan estados vegetativos superiores a V₃, pero su existencia depende en gran medida de la variedad de soja plantada y las condiciones ambientales (ver texto).

Expansión del cultivo de soja. Situación en Uruguay.

La  expansión masiva  de la soja se dio a principios de la década del setenta, sobre todo en el Medio Oeste estadounidense, y a partir de los noventa alcanzó gran auge en el Cono Sur. Hoy en día, Brasil y Argentina se han convertido en el segundo y tercer productor mundial respectivamente (luego de EEUU). Uruguay no ha escapado a ésta realidad, y, actualmente la soja es el cultivo con la mayor superficie implantada en el país. La misma evolucionó desde las 9.000 hectáreas en la temporada 1998/1999 a 400.000 hectáreas en la temporada 2007/2008 (habiendo predicciones de llegar a las 600.000 has en la zafra venidera) con una evolución concomitante en las exportaciones. La soja se cultiva principalmente en el litoral oeste del país (Fuente MGAP, ver figura 3) y la producción anual alcanza las 800.000 toneladas.

En las últimas décadas se ha producido, a través de técnicas de Ingeniería Genética, soja resistente a glifosato (herbicida), lo cual ha aumentado la producción al disminuir la incidencia negativa de las malezas. Ello ha provocado controversia sobre los efectos de dicho cultivo en el ambiente y sus efectos en la salud pública. En el país la introducción de dicha variedad fue a partir de la segunda mitad de los noventa, y en la actualidad, casi la totalidad de la de soja plantada es transgénica (Soja RR; Round-up Ready, con la incorporación de un gen de Agrobacterium sp.).

Figura 3: Superficie sembrada de soja en la temporada 2004-2005.

Los impactos ambientales más fuertes constatados se relacionan con la masiva aplicación de agroquímicos al cultivo. El empleo de aquellos ha aumentado un 400 % en los últimos 5 años. El paquete tecnológico de la soja transgénica, incluye además del glifosato, funguicidas e insecticidas altamente contaminantes, tales como el endosulfán, clorpirifos, y cipermetrina entre otros. Los mismos han demostrado ser muy nocivos para la vida terrestre y acuática, con un alto potencial de bioacumulación. Su persistencia en el ambiente hace que aumenten sus impactos negativos, tanto en la salud humana como en la flora y fauna, provocando desequilibrios en los ecosistemas. En éste sentido se ha constatado grave afectación a los enemigos naturales y resurgencia de plagas. En el caso del endosulfán (organoclorado), existe una campaña a nivel mundial para su eliminación y con respecto al clorpirifos, su uso ya está estrictamente restringido en algunos países de América Latina.

Piezodorus guildinii, la chinche de las leguminosas.

Los insecticidas son empleados para el combate de plagas, siendo las principales que afectan al cultivo las orugas (lepidópteros) y chinches (hemípteros). Los lepidópteros  de mayor significación económica son principalmente dos: Epinotia aporema y Anticarsia gemattalis; mientras que la chinche más importante es Piezodorus

guildinii (figura 4).

P. guildinii posee, como todos los hemípteros, un aparato bucal pico-suctor que le permite penetrar los tejidos vegetales para alimentarse (daños primarios), posibilitando la introducción de bacterias, virus y hongos que pueden causar enfermedades a la planta (daños secundarios). Se ha reportado adicionalmente un daño conocido como “soja loca”, que consiste en la retención foliar de la planta al alcanzar la madurez, lo que dificulta la recolección mecánica de las semillas. Esta especie se encuentra en los sistemas de producción durante todo el año, oscilando entre el cultivo de soja y las leguminosas forrajeras. Debido a su alto nivel poblacional generalmente presente en los agro­ecosistemas y  su ataque directo a las semillas; afecta el rendimiento y la calidad de las mismas. El ataque se da en estados de desarrollo avanzado, momento en que la planta no está en condiciones de compensar los efectos de dicho ataque, convirtiéndola en la plaga más importante del cultivo.

Al poner en peligro el éxito económico del negocio obliga a un estricto control en base a la utilización de insecticidas no selectivos, en general endosulfán. Este insecticida se aplica tanto puro como en mezclas con thiametoxán,  cipermetrina u otros piretroides equivalentes, con el objetivo de potenciar su efecto. Se debe resaltar que hasta el momento no existen insecticidas selectivos para el control de ésta plaga, que puedan oficiar como alternativa al uso de endosulfán. Según Castiglioni P. guildinii  ha comenzado a desarrollar importantes niveles de resistencia a algunos de los productos utilizados para su control, entre ellos endosulfán.

Las aplicaciones de pesticidas en general son más frecuentes a partir de la floración y se intensifica hasta alcanzar la madurez, período en el cuál es más probable y dañino el ataque de la chinche.

El control de plagas alternativo, por rotación de cultivos-pasturas o por enemigos naturales no es empleado en la actualidad.

Figura 4: Piezodorus guildinii; adulto y ninfas de cuarto estadío, ambas consideradas plagas importantes del cultivo de soja.

Todos los inconvenientes numerados permiten visualizar la no sostenibilidad de los agro­ecosistemas sojeros a largo plazo. Por ello son necesarias nuevas alternativas de manejo agronómico, y dentro de ellas medidas de control de plagas más amigables con el medio ambiente.

Comunicación química: los insectos y su relación con el medio.

Entre los animales, los insectos constituyen el taxón que más frecuentemente utiliza sustancias químicas (semioquímicos) en procesos de comunicación y percepción del medio. Los semioquímicos involucrados en comunicación intraespecífica se conocen como feromonas, mientras que los que median comunicación interespecífica son conocidos como aleloquímicos. Éstos suelen dividirse para su estudio en alomonas y kairomonas: las primeras denotan señales químicas adaptativamente favorables para el emisor de la señal, mientras que las segundas benefician al receptor de la señal. En las relaciones planta-insecto, las kairomonas más conocidas son aquellas que contribuyen a la localización por parte de los insectos fitófagos de sus plantas alimenticias.

Dado los progresos alcanzados en los últimos años en la comprensión de los mecanismos de comunicación química entre plantas, y cómo las plantas se defienden de sus agresores herbívoros o patógenos; el uso de semioquímicos cómo herramienta en manejo integrado de plagas (MIP) está llamado a ser una alternativa viable al empleo convencional de pesticidas de síntesis. Resultados alentadores se han obtenido de la manipulación comportamental de insectos en estrategias de push-pull,  a través del uso de feromonas para monitoreo poblacional o confusión sexual, y a través del empleo de elicitores químicos que incrementen el nivel de defensas directas e indirectas de la planta.

Los VOCs, moléculas señal en la naturaleza.

Los compuestos orgánicos volátiles (VOCs) son compuestos químicos liberados a la atmósfera (alta presión de vapor) por fuentes biogénicas o no biogénicas. Se caracterizan por ser compuestos de bajo peso molecular (menor a 500 dalton), en su mayor parte lipofílicos, que responden a una gran diversidad de grupos químicos. En el caso de las fuentes biogénicas, especialmente en plantas, son característicos los derivados isoprenoides (hemiterpenos, monoterpenos y  sesquiterpenos), alcanos, alquenos, cetonas, aldehídos, ésteres, éteres, ácidos e hidrocarburos aromáticos. Los terpenos son los compuestos más prominentes en la mayoría de los casos. La emisión de VOCs en plantas no es homogénea y varía apreciablemente tanto en cantidad como identidad de los compuestos. Ello depende de factores propios del organismo como el estado de desarrollo y genotipo, y de factores ambientales que provocan stress tales como la contaminación, la presencia de organismos detrimentales (fitófagos, patógenos), la duración del fotoperíodo y la temperatura. La antedicha dependencia es característica en la biosíntesis de metabolitos secundarios.

El entendimiento del rol de los VOCs en las interacciones planta-insecto es menor que para los compuestos no volátiles debido las dificultad en su aislamiento, identificación y cuantificación (se encuentran en proporción de ppm o ppb respecto al peso de la planta) y por su naturaleza disipativa. Ello influye en última instancia en el entendimiento del metabolismo y la fisiología vegetal. Varios métodos han sido empleados para aislar VOCs, entre ellos destilación por arrastre con vapor, destilación a vacío, extracción con solventes, condensación en frío y trampas de adsorbentes. Esta última opción es la más adecuada y representativa de las condiciones de emisión in vivo, minimizando contaminantes, y fue la elegida para éste trabajo.

Los VOCs de plantas han sido reportados cómo atrayentes de insectos a sus plantas alimenticias (cumpliendo la función de kairomonas) pero quizá su rol más importante sea como repelentes y deterrentes de fitófagos que hagan a una planta no alimenticia (alomonas). El comportamiento de los insectos es influido tanto por diferencias cualitativas cómo cuantitativas en la pluma de volátiles.

Liu et al han demostrado que las distintas variedades de soja emiten diferentes perfiles de volátiles que pueden influir en la aceptabilidad por parte de un insecto fitófago. Las especies cultivadas parecen ser más apetecibles a los mismos que las especies silvestres.

En la bibliografía se hace una distinción entre los VOCs emitidos por la planta en condiciones normales y los VOCs emitidos bajo herviboría. Éstos últimos son conocidos como HIPVs (herbivore-induced plant volátiles, en inglés) los que generalmente tienen un rol relevante en interacciones tritróficas en la atracción de depredadores o parasitoides del herbívoro (incluso en el caso de volátiles inducidos por pentatómidos; figura 5).

Figura 5: Atracción de una avispa parasitoide por parte de los volátiles de hoja verde (GLVs) liberados por la herbivoría de una oruga.

A la atracción de dichos enemigos naturales por parte de volátiles de la planta se le llama defensa indirecta, y las plantas suelen recurrir a ellas cuando es bajo el nivel de defensas directas (constitutivas o inducidas por la misma planta). Los compuestos que generalmente median la liberación de defensas inducidas son salicilato de metilo (MeSA) y ácido jasmónico. Los mismos son liberados por la planta luego de una cascada de señalización iniciada tras el inicio de la alimentación u oviposición. La sola presencia de dichos compuestos activa los mecanismos de defensa de la planta y la atracción de los parasitoides, no necesitándose la presencia del insecto perjudicial.
El MeSA también está involucrado en interacciones tritróficas en la naturaleza. Zhu et. al demostraron que las plantas de soja altamente atacadas por Aphis glyicine (Homoptera:Aphidae) emiten en alta proporción MeSA, lo que provoca una respuesta en GC-EAD de su principal depredador, Coccinella setempuntacta (Coleoptera:Coccinellidae).

Está bien caracterizada la emisión por parte de las plantas de volátiles de hoja verde (green leaf volatiles, GLV, en inglés), los cuales son alcoholes, cetonas, aldehídos y ésteres alifáticos de hasta 10 átomos de carbono, emitidos por todas las plantas en condiciones in vivo. Muchos de ellos han demostrado tener funciones importantes en la naturaleza; Gardner et al reportan la inhibición de germinación de semillas y del crecimiento de plántulas de soja por parte del hexanal, E-2-hexenal y E-2-nonenal.

Materiales y Métodos

Colecta de VOCs a campo:

Ésta parte del trabajo se realizó en el período enero-abril de 2009, en una campo de soja en la Estación Experimental “Mario Cassinoni” (EEMAC) de Facultad de Agronomía (UdelaR), Paysandú.

Para ello se muestreó en cinco estadios de desarrollo fenológico del cultivo de soja: vegetativo (V₄-V₅ y V₈-V₉), floración (R₂), llenado de vaina (R₅) y madurez fisiológica (R₈). En todos los casos la colecta se realizó de manera semejante.

El dispositivo empleado para la colecta a campo se muestra en la figura 6.

Figura 6: Sistema de colecta para volátiles a campo, aquí ejemplificado para el muestreo en estadios V₈-V_9.

La idea básica fue captar los volátiles (VOCs) in vivo de las plantas de soja. El follaje de las plantas de soja fue embolsado a cierta altura del suelo (por sobre las hojas unifoliadas) de manera de no captar volátiles del mismo; formando una cámara abierta por su extremo inferior. Las bolsas empleadas fueron de poliestireno (Embale Bem, 27 x 41 cm). En el extremo superior de la misma se adosó una columna de vidrio (tipo pipeta Paster; 15.7 cm l. x 0.6 cm d. i.) empacada con 0.1 g de Super Q^® entre dos porciones de lana de vidrio. Simultáneamente se preparó un blanco con una bolsa vacía. Las salidas de ambas columnas fueron unidas a un conector en forma de “T” en cuyo extremo se colocó una bomba de vacío portátil (Apex 1.04; Casella Cel). Así la bomba arrastró la atmósfera circundante a las plantas y los compuestos volátiles fueron recogidos en el lecho de adsorbente. Las condiciones de muestreo fueron las siguientes: flujo de aire: 1.60 L/min; programa de muestreo: 20 horas; sistemas de colecta por duplicado. La temperatura fue variable en virtud de la variación climática diaria. Las bombas fueron colocadas a cierta altura del suelo y protegidas mediante malla sombra dado que al ser expuestas al sol directamente, las condiciones de funcionamiento pueden variar. Las bolsas también fueron parcialmente protegidas del calor mediante malla sombra para evitar el marchitamiento de las plantas muestreadas. Con ello también se mitiga en parte la descomposición, como consecuencia del calor, del material constituyente de las bolsas.

Extracción de VOCs:

Para la extracción de los VOCs se procedió a la elución de las columnas provenientes de los muestreos (tanto de blanco como de soja) con 2 ml de n- hexano (95 % de pureza, Mallinckrodt Chemicals), adicionándose 100 µl de n­tridecano (0.05408 mg/ml) cómo estándar interno. A dicho extracto se lo concentró bajo corriente gaseosa de N₂ hasta 100 µl, y se lo almacenó a -18 ºC hasta su posterior análisis químico y comportamental.

Análisis por cromatografía gaseosa (GC):

Para ello se empleó un cromatógrafo Hewlett-Packard 5890 serie II con las siguientes condiciones: gas carrier: H₂; T inyector: 220 ºC; T detector (FID): 250 ºC; método: 40 ºC (4 min)- 10 ºC/min- 240 ºC (5 min); Inyección Splitless, Columna Elite 5 (5% difenil- 95% dimetil polisiloxano; 30 m x 0.25 mm d.i. x 0.25 μm).

El cromatógrafo se conectó a una PC equipada con el Software HP Chem Station, donde pudo visualizarse los cromatogramas y ajustar las condiciones de funcionamiento del equipo.

La determinación de picos pertenecientes a extractos de soja fue realizada por comparación entre los cromatogramas de los mismos y los correspondientes de los blancos.

Se calcularon los índices de retención (IR) de los componentes de los extractos de VOCs de soja por inyección de 1 µl del extracto bajo las mismas condiciones cromatográficas que en el caso anterior, en paralelo a 0.5 µl de solución de Kovats (C₈, C₁₀, C₁₂, C₁₄, C₁₆, C₁₈, C₁₉, C₂₀, C₂₂, C₂₆, C_32; 100 ppm).

Análisis por GC acoplado a espectrometría de masas (GC-MS):

Los extractos de todos los estadios fueron inyectados en modalidad splitless por duplicado (1 µl) en un GC-MS Shimadzu QP2010 Plus. La columna empleada fue OPTIMA- 5-MS (30 m x 0.25 mm x 0.25 μm) con He como gas portador. La fuente de ionización fue de impacto electrónico (IE) a 70-eV sometida a 200 ºC y con la línea de transferencia a 300 ºC. La cuantificación fue realizada por comparación de áreas con el estándar interno de n-tridecano. Adicionalmente se inyectó 0.5 µl de la solución de Kovats para un segundo cálculo de índices de retención (IR).

La identificación de los compuestos fue mediante comparación de sus IR y espectros de masas con la datos de la base de datos SHIM 2205 ⁽¹⁵⁾.Como criterio de identificación se tomó un porcentaje de similitud de espectros mayor al 85%, y una diferencia de índices de retención no mayor a 10 unidades. Identificación tentativa se le llamó a aquella en la que sólo se pudo contar con el porcentaje de similitud del espectro de masas, tomándose en éste caso como criterio un 90% de similitud en los mismos.  Aquellos compuestos que se encontraron en los extractos de soja pero no pudo ser determinada su identidad fueron incluídos en la cantidad total de VOCs reportada.

Respuesta comportamental de insectos a los VOCs:

Bioensayos. Olfatómetro en "Y": 

Tanto machos y hembras adultos de P. guildinii fueron colocados en el extremo basal de la “Y” del olfatómetro, donde se encontraron frente a dos opciones: el blanco o el extracto de VOCs (muestreos R₅ y R₈).

Físicamente el olfatómetro es un block de acrílico con una cavidad en forma de Y, aprisionado entre dos placas planas de vidrio. El tronco del dispositivo mide 20 cm y cada brazo 17 cm (ver figura 7); tanto en el tronco como en cada brazo se trazaron arbitrariamente líneas a la mitad de su longitud, para cuantificar la respuesta del insecto. 

Figura 7: Olfatómetro en Y donde se realizaron los estudios comportamentales de preferencia de P. guildinii hacia los VOCs de soja.

La fuente de olor se generó absorbiendo 3 µl de la muestra (sea extracto o blanco de n-hexano) en un papel de filtro (3 x 1 cm) doblado a la mitad a modo de carpa. Tanto los papeles de filtro con el blanco como con el extracto fueron colocados en cámaras cilíndricas de vidrio, las cuales tuvieron conexión con los respectivos brazos del olfatómetro. El aire que arrastró los volátiles fue conducido por caños de goma desde una bomba de diafragma (Aquarium Air Pump, LifeTech 9830), pasando por un humidificador de agua destilada y un lecho de carbón activado antes de llegar a las cámaras de volatilización. El flujo se reguló a 2.2 L/min, y se utilizó luz roja para emular condiciones nocturnas. Ello responde al hecho de que en estudios preliminares de movilidad en olfatómetro en Y (blanco contra blanco), los insectos fueron más móviles bajo luz roja que bajo luz blanca.

La respuesta del insecto se observó durante 15 minutos, registrándose la primera elección de brazo, tiempo de residencia en cada brazo y número de veces que prefirió cada uno de ellos. Cada individuo fue utilizado una única vez y entre ensayos sucesivos se limpió el olfatómetro con etanol (70%), y se alternaron las cámaras de volatilización.

La preferencia por control o tratamiento se evaluó estadísticamente mediante el test de rangos pareados de Wilcoxon para el número de entradas y tiempo de permanencia en cada brazo. La primera elección de un brazo u otro se analizó por el test de Chi cuadrado.

Análisis preliminar de los VOCs por GC-­EAD:

Los ensayos electrofisiológicos son claves para la Ecología Química. En los electroantenogramas (EAG) se registra la diferencia de potencial entre los extremos de la antena de un insecto como respuesta a un determinado estímulo. Esta metodología puede ser acoplada a un cromatógrafo de gases (haciendo las veces de detector conocido como EAD; ver figura 8), de manera de poder evaluar la respuesta de la antena del insecto a los diferentes compuestos que eluyen de la columna, simultáneamente a la detección de dichos compuestos por el detector usual de GC.

Figura 8: cromatógrafo de gases acoplado a detector de electroantenograma (GC-EAD). En la imagen de la izquierda se puede observar en detalle la antena entre los electrodos.

Si algún compuesto químico estimula dicha antena, ella emite un impulso eléctrico que es amplificado y registrado por un software. De ésta manera se tiene una comparación a tiempo real de los compuestos químicos eluídos y sus respectivas respuestas de las antenas de los insectos.

Dado que las cantidades de semioquímicos implicadas en las interacciones biológicas entre organismos vivos son ínfimas (del orden de pg), tal detector es muy sensible. Se pueden registrar respuestas electrofisiológicas en los cromatogramas en donde no se puede visualizar ningún pico mediante los detectores usuales de GC.

Para llevar a cabo el análisis se diseccionó la antena del insecto en su base, se la colocó entre dos electrodos de plata y se la fijó a los mismos mediante un gel conductor. Este es el encargado, en última instancia, de transmitir el impulso nervioso de la antena a los electrodos. Los electrodos se conectaron a un amplificador, y éste a un registrador en un PC, mediante  software HP Chem Station. Dado que la respuesta de las antenas no fue consistente, se procedió a realizar un cambio en el sistema de detección, utilizando como electrodos hilos de plata sumergidos en una solución llamada de Ringer (solución de 0.755 % NaCl, 0.064 % KCl; 0.022 % CaCl₂, 0.173 % MgCl₂, 0.086% Na₂HCO₃  y 0.061 % Na₃PO₄) que simula las condiciones osmóticas de la hemolinfa.

A los efectos de la realización de éstos análisis, los insectos fueron colocados por 15 minutos en una conservadora con escarchas de hielo, condiciones bajo las cuales los mismos permanecen inmovilizados (entran en un estado de quiescencia), quedando aptos para la disección de las antenas. Se procuró colocar la antena inmediatamente después de la disección para formar parte del detector, y que la señal de la misma permaneciera estable (visualizada en el registrador).

Para que la respuesta detectada de la antena sea consistente, se pretende que la misma se repita en al menos dos análisis consecutivos, lo cual no pudo ser verificado en ninguna de las condiciones planteadas.

En éste trabajo, debido a problemas de disponibilidad de insectos y de extractos, se realizaron apenas 4 corridas de GC­EAD con antenas de machos (dado que habían mostrado una leve tendencia de atracción de VOCs de madurez en primera opción de olfatómetro) y extractos de R₈ (el más afectado por las chinches en observaciones de campo).

Resultados

Muestreo 1 (V₄-V₅):

En éste muestreo no hubo diferencias apreciables entre el blanco y la muestra, detectándose dos picos que no pudieron ser identificados por comparación con biblioteca de espectros de masa.

Muestreo 2 (V₈-V₉):

En el mismo se detectaron diferencias apreciables del extracto de VOCs de soja respecto del blanco. Los compuestos identificados se ilustran en la figura 9.

La discriminación según el tipo de compuestos identificados fue la siguiente:

Cetonas: 5-hepten­2-ona–6-metil (GLV); geranil cetona.

Hidrocarburos monoterpenos: (E, β) ocimeno.

Hidrocarburos sesquiterpenos: β- humuleno; α- zingibereno,.

Aldehídos: tetradecanal.

Ésteres: salicilato de metilo, butanoato de 3-(Z)-hexen-1-ilo (GLV).

Éteres: epóxido de farneseno (tentativo).

Figura 9: VOCs de soja identificados en el muestreo 2. A) 5-hepten­2­ona–6-metil, B) geranil acetona, C) (E, β)-ocimeno, D) β-humuleno, E) α-zingibereno, F) (E,E-α) farneseno G) tetradecanal H) salicilato de metilo I) butanoato de 3-(Z)­hexen-1-ilo.

Muestreo 3 (R₂):

En éste muestreo también se registraron diferencias apreciables respecto del blanco y de los restantes muestreos.

La discriminación según el tipo de compuestos identificados fue la siguiente:

Alcoholes: amil vinil carbinol (GLV).

Hidrocarburos monoterpenos: D-limoneno, (E, β) ocimeno,

Hidrocarburos sesquiterpenos: α-copaeno, β-elemeno, β-humuleno; (E,E-α) farneseno.

Ésteres: butanoato de 3-(Z)­hexen-1-ilo (GLV).

Compuestos nitrogenados: farnesil cianuro (tentativo).

Figura 10: VOCs de soja identificados en el muestreo 3. A) amil vinil carbinol, B) limoneno, C) (E, β)­ ocimeno, D) α-copaeno E) β-elemeno F) β -humuleno, G) (E,E-α) farneseno, H) butanoato de 3-(Z)-hexen-1-ilo.

Muestreo 4 (R₅):

Si bien éste muestreo fue en el que más se caracterizaron VOCs, la identificación se logró para pocos de ellos. Existen diferencias apreciables tanto a nivel cuantitativo como cualitativo respecto de los restantes muestreos.

La discriminación según el tipo de compuestos identificados fue la siguiente:

Hidrocarburos aromáticos: tolueno (tentativo).

Cetonas: 3-hexanona (GLV) (tentativo).

Hidrocarburos monoterpenos: α-pineno, (E, β)-ocimeno.

Hidrocarburos sesquiterpenos: β-humuleno; (E,E-α) farneseno.

Ésteres: acetato de 3-(Z)­hexen-1-ilo (GLV).

Aldehídos: 4-etilbenzaldehído (tentativo).

Figura 11: VOCs de soja identificados en el muestreo 4. A) α-pineno, B) (E, β)-ocimeno, C) β-humuleno, D) (E,E-α)­farneseno, E) acetato de 3-(Z)­hexen-1-ilo.

Muestreo 5 (R₈):

En éste muestreo, correspondiente a la madurez fisiológica del cultivo, se obtuvieron muy pocos VOCs. Aún así se pudieron identificar algunos no presentes en los restantes muestreos como así también variación cuantitativa de compuestos comunes a los otros muestreos.

La discriminación según el tipo de compuestos identificados fue la siguiente:

Alcoholes: 3(Z)-hexen (1)ol (GLV).

Hidrocarburos monoterpenos: (E, β)-ocimeno.

Ésteres: acetato de 3(Z)-hexen-1-ilo (GLV).

Aldehídos: 2-(E)hexenal (GLV).

Figura 12 VOCs de soja identificados en el muestreo 5. A) 3­(Z)-hexen- (1)-ol , B) (E, β)­ocimeno, C) acetato de 3­(Z)-hexen-1-ilo, D) 2-(E)-hexenal.

Evolución de cantidades de los compuestos comunes a muestreos:

Como pudo ser apreciado anteriormente, hay ciertos compuestos comunes a los distintos muestreos.

En éste apartado se pretende representar las evoluciones individuales y colectivas de dichos VOCs (figuras 13 y 14).

Se puede apreciar que los compuestos (E,β)-ocimeno, (E,E-α)-farneseno y β­-humuleno, siguen aproximadamente la tendencia general de la evolución de las cantidades totales de VOCs representada por el gráfico verde de la figura 13. En el mismo se puede ver claramente un máximo cuantitativo de emisión en floración.

Sin embargo, los GLVs butanoato de 3­(Z)-hexen-1-ilo y acetato de 3­(Z)-hexen-1-ilo, presentan el máximo de emisión en el estadio vegetativo avanzado y de llenado de vainas, respectivamente.

Figura 13: Evolución de los VOCs de soja (verde) y del (E,E-α)-farneseno (rojo) a lo largo de la temporada de desarrollo del cultivo de soja. Cantidades equivalentes a ng de tridecano.

Figura 14: Evolución de (E,β)-ocimeno (A) y de β-humuleno (B) a lo largo del desarrollo fenológico de la soja. Las cantidades se expresan en ng equivalentes de tridecano.

Respuesta comportamental de insectos a los VOCs:

Muestreo 4, R_5.

A continuación se presentan los resultados para machos y hembras para las tres variables medidas en olfatómetro en Y.

Figura 15: Resultados comportamentales en olfatómetro para machos (N=15) y hembras (N=8) de P. guildinii en cuanto a número de entradas en cada compartimento (A), porcentaje de elección de primera opción (B) y tiempo de permanencia en cada brazo (C) para los VOCs de R₅. Las hembras se visualizan en color claro y los machos en oscuro. Nota: para las hembras no se realizó análisis estadístico debido al bajo número de individuos.

Muestreo 5, R_8.

A continuación se presentan los resultados para machos y hembras para las tres variables medidas en olfatómetro en Y.

Figura 16: Resultados comportamentales en olfactómetro para machos (N=15) y hembras (N=14) de P. guildinii en cuanto a número de entradas en cada compartimento (A), porcentaje de elección de primera opción (B) y tiempo de permanencia en cada brazo (C) para los VOCs de R₈. Las hembras se visualizan en color claro y los machos en oscuro.

Tratamiento estadístico e interpretación:

En el caso del muestreo en R₅ para los individuos machos, en las variables de porcentaje de primera elección (Test Chi cuadrado; p> 0.4) y promedio de número de entradas (Test de Wilcoxon; p>0.1) a cada brazo; hay una leve tendencia aunque no significativa de atracción de los mismos hacia los VOCs de soja. En el caso de la variable tiempo de residencia, tampoco hay diferencia significativa entre ambos tratamientos, aunque la tendencia es a que la permanencia en ambos brazos sea prácticamente la misma, según lo ilustra la figura 15 C.

En el mismo muestreo para las hembras, no se pueden hacer inferencias ninguna porque debido a disponibilidad de insectos (en cantidad y estado fisiológico adecuado), no se consiguió un número mínimo de individuos para lograr significancia estadística. Aún, a pesar de lo antedicho, parece haber una tendencia de atracción hacia los VOCs de soja en cuanto a porcentaje de elección de primera opción y tiempo de permanencia en cada brazo.

Para el estadio R₈ e individuos machos se observa disparidad en cuanto al valor de las distintas variables, ya que hay una tendencia (nuevamente no significativa) a elegir primera opción (Test Chi cuadrado; p> 0.1) con tratamiento de soja. Pero he aquí que las otras dos variables, tanto promedio de número de entradas (Test de Wilcoxon; p>0.1) y tiempo de residencia, sean favorables al blanco. En el caso de la última variable, hay significancia estadística de repulsión a los VOCs de soja (ejemplificado por el cuadro de error de la figura 16 C). Ello puede interpretarse en el sentido de que el insecto sensa el ambiente del olfatómetro y percibe un estímulo que lo repele y le hace huir de dicho brazo.

En el caso de las hembras parece también haber una leve tendencia (no significativa) a la repulsión de los VOCs, en las variables promedio de número de entradas (Test de Wilcoxon; p>0.4) y primera opción (Test Chi cuadrado; p> 0.1).

Del estudio bibliográfico de éste sistema y en la procura de las causas de éste comportamiento inusual surgió que, el estándar interno usado (n-tridecano), es uno de los principales compuesto defensivos de P. guildinii ante parasitoides, información ésta que no se tenía al principio del trabajo. De ello se puede formular la hipótesis de que el n-tridecano, aparte de ser un compuesto defensivo, pueda actuar como feromona de alarma para los individuos de P. guildinii. Evidentemente para comprobar o refutar dicha hipótesis se deberían hacer más bioensayos aumentando el número de individuos testados.

Aún así, ello sirvió de aprendizaje para los muestreos realizados en la temporada 2009-2010, los cuales se hicieron con tetradecano como estándar interno. Los resultados de dichos muestreos escapan a los objetivos y tiempo de duración de la tesis de Licenciatura y no son presentados aquí.

Análisis de los VOCs por GC­-EAD:

En las corridas preliminares realizadas no pudo observarse ninguna respuesta que indique atracción hacia alguno de los VOCs. Sin embargo, se sabe (González, A.; comunicación personal), que las antenas de hemípteros no presentan padrones de reacción tan claros como lepidópteros en EAD. Ello es cierto para feromonas, y aún más para posibles kairomonas debido a que la relación planta-insecto no es tan específica ni determinante para la sobrevivencia de la especie (P. guildinii es polífaga) como la que surge de la emisión de aquellas.

Discusión

Un aspecto importante a destacar, entre los factores bióticos que pueden influenciar los resultados aquí obtenidos, es que al realizar el muestreo a campo el cultivo se encuentra sometido a un complejo de plagas y no solamente a la plaga en estudio. Ejemplo de ello es que en la temporada de muestreo se encontraron altas poblaciones de la arañuela (Tetranychus urticae, Acarina) y Anticarsia gemattalis (Lepidoptera). Asimismo, no debe despreciarse la posibilidad de obtener VOCs de otras fuentes durante los muestreos a campo, por ejemplo de la microfauna asociada a las plantas, o del ambiente circundante (que incluye otras plantas tales como malezas). A modo de ejemplo, compuestos como el 2-(E)-hexenal, α-pineno, α-zingibereno y (E,β)-ocimeno (informados aquí como VOCs de soja), se han reportado como emisiones de machos y hembras vírgenes de P. guildinii.

Perfil químico de VOCs:

En cuanto a la cantidad relativa de VOCs emitidos, se pudo observar un aumento paulatino hasta el máximo en la floración, seguido de un decrecimiento abrupto hasta la madurez fisiológica, como se puede apreciar en la figura 13. Rostás et. al. reportó menor cantidad de VOCs con el desarrollo fenológico de la soja , pero teniendo en cuenta solamente los estadios V₃ y R₄ y no la floración.

En cuanto a la diversidad química detectada (medida cómo la cantidad de compuestos diferentes), se puede observar un máximo en el estadio de desarrollo de llenado de vainas (R₅).

Según lo mostrado en las figuras 13 y 14, β-humuleno, (E,E-α)-farneseno y β-E-ocimeno, parecen seguir (dentro de ciertos límites de error experimental), la tendencia general de variación de las cantidades relativas de VOCs mostrada en la figura 13. El β-E-ocimeno muestra un leve incremento hacia el final de la temporada, lo que podría deberse a la emisión de P. guildinii, especie que alcanzó altas poblaciones hacia el final de la temporada.

(E,E-α)-farneseno aparece como el compuesto ampliamente mayoritario en los muestreos V₈-V₉ y R₂, siendo mayor la proporción de este compuesto que la suma de todos los restantes VOCs caracterizados en el muestreo 2 (56.5% del total de VOCs) y el 46.2 % de los VOCs en el muestreo 3. En el muestreo correspondiente a llenado de vainas (R₅) es apenas el 11.5 % de los VOCs y no fue detectado en la madurez fisiológica. Van de Boom halló dicho compuesto en una proporción del 5% de los VOCs en soja vegetativa (de 5 semanas, posiblemente V₃-V₄), donde es inducido por plantas sometidas a daño por T. urticae. Esto justificaría que dicho compuesto no fuera detectado en el estadio vegetativo temprano en nuestro estudio. Sin embargo, Rostás lo encontró como mayoritario en V₃ , lo que puede reflejar propiamente el efecto de las condiciones ambientales y las variedades de soja empleadas.

En el muestreo correspondiente al estado vegetativo avanzado se pudo observar la presencia de salicilato de metilo (segundo compuesto mayoritario, 5% del total de VOCs), un compuesto conocido por ser elicitor de defensas químicas indirectas de la planta como consecuencia de la herviboría de muchas especies, incluso de T. urticae. Dicho compuesto ha sido reportado también como atractivo a depredadores en interacciones tritróficas y se ha planteado cómo un compuesto clave en la resistencia inducida contra ataques fúngicos, virales o bacterianos.

El amil vinil carbinol (1-octen-3-ol) fue detectado solamente en el muestreo correspondiente a floración. Sin embargo,  Boué et. al. determinaron que el mismo aumentaba a medida que el cultivo alcanza la madurez por emisión específica de las semillas, lo que puede deberse también a la variabilidad de éste tipo de compuestos.

El acetato de 3-(Z)-hexen-1-ilo, un volátil de hoja verde (GLV), es el componente mayoritario del muestreo 4 (llenado de vainas), siendo el 26.9 % del total de los VOCs detectados, seguido por el α-pineno con un 15.1%. Anteriormente Van Den Boom et al. reportaron al primero de ellos cómo componente mayoritario de los VOCs inducidos por la infestación de T. urticae en el estadio vegetativo avanzado.

En el muestreo 5 (madurez fisiológica), el 2-(E)-hexenal (otro GLV) es el componente mayoritario, alcanzando el 47.8 % de todos los VOCs. En éste muestreo se detectan otros dos GLVs: 3-(Z)-hexen-(1)-ol y acetato de 3-(Z)-hexen-1-ilo.

Si bien en todos los muestreos (salvo el primero) se detectaron GLVs, resulta interesante que los mismos hayan sido detectados como compuestos mayoritarios en los estados avanzados de madurez, donde no deberían estar apreciablemente presentes, dado que las hojas verdes son escasas. Esto puede deberse a la retención foliar de la soja, que hace que la misma llegue al final de la temporada con hojas verdes, o a la emisión por parte de las chinches que colonizaban las plantas hacia el final de la temporada.

El 2-(E)-hexenal posee probada actividad antifúngica, siendo su biosíntesis activada ante el ataque de herbívoros o patógenos. Mientras Boué reporta una disminución del contenido de este aldehído en R₇ y R₈ respecto a R₆ y a estadios vegetativos y de floración en soja no atacada, en éste trabajo se encontró el patrón contrario, lo que puede deberse a una respuesta de la planta inducida por el ataque de plagas.

En el muestreo en R₅ la cetona 3-hexanona fue tentativamente identificada, y ha sido reportada anteriormente. Dicho autor confirma la presencia de la misma en R₆, R₇ y R₈, con una disminución de la cantidad de la misma hasta alcanzar la madurez, lo que explicaría que no se hubiera determinado en el presente trabajo en R₈. Incluso el mismo autor postula dicho compuesto como quimioindicador de los estados de desarrollo R₆ y R₇.

Los compuestos nóveles respecto de reportes anteriores fueron tetradecanal (V₈-V₉) α-copaeno, β-elemeno (R₂) y tentativamente farnesil cianuro (V₈-V₉ y R₂), tolueno y 4-etil benzaldehído.

La posible presencia de farnesil cianuro en el estadio de floración no es sorprendente, ya que se han reportado varias oximas y nitrilos dentro de los VOCs de soja, tanto de plantas sanas como dañadas. Asimismo, dado que el (E,E-α)-farneseno es el compuesto mayoritario en ambos estadios, no es de extrañar la presencia de vías metabólicas adicionales activas para su biotransformación.

Estudios comportamentales:

En el muestreo en R₅, P. guildinii, tanto en individuos machos como hembras mostró  una leve tendencia a elegir como primera opción los extractos de soja, mientras que la diferencia en el valor de las variables número de entradas a cada brazo y tiempo de permanencia entre soja y blanco no es significativa.

En el muestreo en R₈, por el contario, machos y hembras muestran una leve tendencia a entrar más veces al brazo del blanco que al brazo de los VOCs de soja. En cuanto al tiempo de residencia, hay una tendencia significativa de repulsión de machos hacia el brazo de los VOCs. Mientras tanto, en la elección de primera opción se obtuvieron resultados contrapuestos entre machos y hembras, los machos con tendencia de atracción hacia los VOCs de soja y las hembras de repulsión a los mismos.

Lo antedicho permite apreciar lo complejo que puede ser el estudio del comportamiento animal. Aún así en éste caso puede haber incidencia directa del estándar interno en dicho comportamiento, ya que por falta de información se incurrió a uno de los principales compuestos defensivos secretados por las chinches.

Conclusiones y Perspectivas

En éste trabajo se identificaron VOCs de soja reportados anteriormente y se reporta la existencia de algunos volátiles nuevos.

La evaluación comportamental hacia los VOCs, parece ser poco clara con resultados contrapuestos para R₅ y R₈, aunque puede haberse debido a errores de la metodología utilizada. Los estudios electroantenográficos hasta el momento no han arrojado ningún resultado concluyente.

Aunque no se ha obtenido evidencia comportamental y electrofisiológica, se seguirá investigando sobre las bases químicas de la comunicación interespecífica entre P. guildinii y G. max. Una aliciente importante para éste trabajo es el hecho de que a campo se ha observado (Castiglioni, E.; comunicación personal) un rápido aumento de la población de la plaga en un corto período de tiempo posterior a la floración. Las bases de éste comportamiento pueden subyacer en la percepción por parte de los insectos de un estímulo químico proveniente de la planta (kairomona) que ha sido adaptativamente seleccionado para la ubicación de la fuente de alimentación.